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Método de imunoblot como aliado para o diagnóstico de doenças gastrointestinais autoimunes

22/07/2021 - por equipe EUROHub, hub de geração e disseminação do saber científico da EUROIMMUN Brasil

O método imunoblot é muito utilizado para o diagnóstico confirmatório de doenças infecciosas, como HIV e HTLV, mas seu uso ainda é raro para a investigação de doenças autoimunes. E isso acontece porque essa possibilidade é pouco conhecida no mercado de medicina diagnóstica. “Dentro do espectro das doenças autoimunes, a técnica tem muitas vantagens. Ela pode ser usada para o diagnóstico confirmatório de doenças gastrointestinais autoimunes, de autoanticorpos associados a padrões de FAN em doenças reumáticas sistêmicas e até de doenças autoimunes neurológicas, como a síndrome paraneoplásica”, lista Leticia D'Argenio Garcia, biomédica, doutora em ciências da saúde e especialista em pesquisa e treinamento da EUROIMMUN Brasil.

Doenças autoimunes são caracterizadas pela perda da tolerância imunológica. Como a função do sistema imune é tolerar tudo aquilo que é do próprio organismo e reagir a tudo o que vem de fora com uma manifestação clínica, a autoimunidade acontece quando os alertas são emitidos sem que haja nenhum agente externo. “No caso das doenças gastrointestinais, as principais manifestações são sintomas inespecíficos, como dor abdominal, enjoo e diarreia. Esses sintomas podem indicar várias doenças diferentes e até mesmo quadros mais simples, como uma infecção aguda. Por isso, é importante ter um exame que ajuda a diferenciar a condição autoimune”, enfatiza Letícia. 

Até bem pouco tempo, essa diferenciação só era possível a partir de uma técnica de diagnóstico in vitro clássica chamada western blot, muito usada em pesquisas, conforme explica a biomédica: “O western blot é um exame que necessita de muitas etapas diferentes, realizadas sequencialmente. Por isso, é considerado um teste complexo. Quando a metodologia migrou para o laboratório de análises clínicas, passou a ser mais simplificada e a se chamar imunoblot. E, agora, a EUROIMMUN desenvolveu uma versão do método ainda mais simples, rápida e com resultado mais preciso, denominada EUROLINE.”

A principal diferença do EUROLINE para os outros métodos é que ele traz as bandas em lugares fixos - uma vantagem fundamental para facilitar a leitura dos resultados. Para entender porquê, é preciso conhecer e comparar a novidade com o western blot clássico. Ambos começam a ser feitos a partir de um “lisado” de células ou de uma solução que contém as proteínas que precisam ser separadas. Mas a forma como essa separação é feita é muito diferente em cada método. 

No western blot, a mistura é colocada em um gel preparado em laboratório para que o técnico possa aplicar uma corrente elétrica que separa as proteínas de acordo com seu peso molecular. “Com a carga elétrica, as proteínas ‘correm’ mais ou menos, de acordo com seu próprio peso e com a trama do gel. Dependendo do que se quer separar é combinada uma porcentagem de agarose que ajuda a determinar o local onde as moléculas vão parar”, conta Letícia. 

Já o EUROLINE não utiliza corrente elétrica nem gel, separando as proteínas por uma metodologia chamada HPLC, sigla para cromatografia líquida de alta performance: “Nesse método, o lisado é colocado em um aparelho que trabalha em duas fases, a líquida e a móvel. Na primeira delas, a solução é arrastada pelo aparelho, para que, na fase móvel, ela percorra uma coluna onde as proteínas se ligam por afinidade. Tudo isso precisa ser calibrado de forma que o técnico saiba em quanto tempo uma determinada substância percorre a máquina até sair completamente pura para ser recolhida, garantindo uma maior sensibilidade e especificidade ao teste”, descreve a biomédica. 

Depois dessa primeira etapa de separação das proteínas, os testes continuam a seguir caminhos diferentes. No western blot, o gel que já está com as proteínas separadas é transferido, também, por meio de uma corrente elétrica para uma membrana de papel. “A dificuldade maior é que falta uma padronização a esse tipo de teste, porque, dependendo do tipo de gel e da corrente elétrica utilizada, a banda fica marcada em um ponto diferente da membrana, o que deixa a leitura do resultado mais difícil e confusa”, esclarece a especialista. 

Já as proteínas puramente separadas por HPLC são usadas para montar os chips que serão grudados em lugares marcados nas tiras do EUROLINE. “As proteínas puras são colocadas em uma membrana, que será cortada no formato de um chip e fixada na tira plástica em locais conhecidos para facilitar a interpretação dos resultados”, descreve Letícia. Depois dessa montagem, é preciso apenas incubar com a amostra do paciente, adicionar o anticorpo secundário, o substrato que gera uma cor roxa e levar o EUROLINE para ser escaneado e interpretado no EUROLineScan, onde a leitura banda a banda será feita de forma a quantificar o anticorpo identificado no resultado. 

O método imunoblot EUROLINE é realizado em apenas 1h45 e em temperatura ambiente, com a vantagem de poder ser totalmente automatizado com o uso da EUROBlotOne ou semi-automatizado com a EUROBlotMaster, que só não faz a pipetagem da amostra. 

No caso das doenças gastrointestinais autoimunes, o método imunoblot é indicado para fazer a diferenciação de algumas dessas patologias, já que os sintomas são muito parecidos. No kit DL 1360 da EUROIMMUN, por exemplo, os chips terão quatro antígenos característicos de três doenças gastrointestinais autoimunes: 

1- Transglutaminase tecidual (GAF-3X), que está ligada à doença celíaca; 

2- Células parietais (PCA), relacionadas à gastrite autoimune; 

3- Fator intrínseco (IFD), que detecta a anemia perniciosa, pois o corpo necessita dessa proteína para absorver vitamina B12, e também está relacionado à gastrite autoimune;

4- Saccharomyces Cerevisiae (ASCA), que está relacionado à doença de Crohn. 

Em casos de pacientes que reclamam de quadros persistentes de diarreia e perda de peso, a suspeita pela doença celíaca ou pela doença de Crohn costuma acontecer paralelamente e só é confirmada depois dos testes diagnósticos. “Até agora, o médico gastroenterologista clínico precisava solicitar exames de sorologia separados para investigar o ASCA e a GAF-3X e fazer uma triagem inicial. Mas, como esses exames sozinhos não fecham o diagnóstico, dependendo do resultado, também era preciso pedir uma biópsia via colonoscopia/endoscopia, um método invasivo. Já a gastrite autoimune era ainda mais difícil de diagnosticar porque o exame mais solicitado era a endoscopia digestiva, que não diferencia a condição autoimune da doença. Portanto, uma das principais vantagens do EUROLINE é a chance de identificar essas quatro condições e em um único exame, que ainda fica pronto em poucas horas”, resume Letícia.
O maior benefício aos pacientes é a oportunidade de iniciar o tratamento de forma precoce e, assim, evitar que a manifestação clínica dos sintomas comprometa o sistema gastrointestinal de forma permanente. “No caso do fator intrínseco secretado pelas células parietais, por exemplo, o autoanticorpo contra este fator é um bom marcador precoce para o diagnóstico da gastrite autoimune pois ele aparece logo no estágio inicial da doença. Sem dúvida uma grande vantagem para qualquer tratamento”, finaliza a especialista. 

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EUROIMMUN - Técnica de Imunoblot

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O intestino e o sistema imune - Sociedade Brasileira de Imunologia

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